哈佛大學(xué) Wyss 研究所和瑞士蘇黎世聯邦理(lǐ)工(gōng)學(xué)院的一個合作(zuò)研究小(xiǎo)組已經在人類基因組序列的動蕩海洋中(zhōng)确定了基因組安(ān)全港 (GSH)，以将治療基因放入其中(zhōng)。作(zuò)為(wèi)驗證的一部分(fēn)，他(tā)們将熒光 GFP 報告基因插入到候選 GSHs 并随着時間的推移跟蹤其表達。GSH 可(kě)以在未來的基因和細胞療法中(zhōng)實現更安(ān)全、更持久的基因表達。這幅插圖為(wèi)該團隊赢得了該研究發表的細胞報告方法問題的封面。圖片來源：Erik Aznauryan

哈佛大學(xué) Wyss 研究所、哈佛醫(yī)學(xué)院和蘇黎世聯邦理(lǐ)工(gōng)學(xué)院的研究人員預測并驗證了治療基因的基因組安(ān)全港，從而實現更安(ān)全、更有(yǒu)效和可(kě)預測的基因和細胞療法。

許多(duō)未來用(yòng)于治療癌症、罕見遺傳病和其他(tā)疾病等疾病的基因和細胞療法可(kě)以通過所謂的“基因組安(ān)全港 (GSH)”提高其功效、持久性和可(kě)預測性。這些是人類基因組中(zhōng)的着陸點，能(néng)夠安(ān)全地容納新(xīn)的治療基因，而不會導緻細胞基因組發生其他(tā)可(kě)能(néng)對患者構成風險的意外變化。

然而，尋找具(jù)有(yǒu)臨床轉化潛力的 GSH 與為(wèi)航天器尋找月球着陸點一樣困難——該着陸點必須位于平坦且平易近人的區(qū)域，不能(néng)太陡且被大山(shān)或懸崖包圍，提供良好的能(néng)見度，并且能(néng)夠實現安(ān)全返回。同樣，GSH 需要通過基因組編輯技(jì )術獲得，不受基因和其他(tā)功能(néng)序列等物(wù)理(lǐ)障礙的影響，并允許“着陸”治療基因的高、穩定和安(ān)全表達。

到目前為(wèi)止，僅探索了少數候選 GSH，它們都帶有(yǒu)某些警告。它們要麽位于基因相對密集的基因組區(qū)域，這意味着它們中(zhōng)的一個或幾個可(kě)能(néng)被插入其附近的治療基因損害其功能(néng)，或者它們包含可(kě)能(néng)無意中(zhōng)在癌症發展中(zhōng)發揮作(zuò)用(yòng)的基因活性。此外，尚未分(fēn)析候選 GSH 是否存在調節元件，這些調節元件雖然不是基因本身，但可(kě)以從遠(yuǎn)處調節基因的表達，也沒有(yǒu)分(fēn)析插入的基因是否會改變整個基因組細胞中(zhōng)的全局基因表達模式。

現在，哈佛大學(xué) Wyss 生物(wù)啓發工(gōng)程研究所、哈佛醫(yī)學(xué)院 (HMS) 和瑞士蘇黎世聯邦理(lǐ)工(gōng)學(xué)院的研究人員合作(zuò)開發了一種計算方法來識别 GSH 位點，這些位點具(jù)有(yǒu)顯着更高的安(ān)全插入治療基因的潛力和它們在許多(duō)細胞類型中(zhōng)的持久表達。對于 2,000 個預測的 GSH 位點中(zhōng)的兩個，該團隊提供了深入驗證，并考慮了針對皮膚病的過繼性 T 細胞療法和體(tǐ)内基因療法。通過改造已識别的 GSH 位點，分(fēn)别在 T 細胞中(zhōng)攜帶報告基因，在皮膚細胞中(zhōng)攜帶治療基因，他(tā)們證明了新(xīn)引入基因的安(ān)全和持久表達。該研究發表在Cell Reports Methods上。

“雖然 GSH 可(kě)以用(yòng)作(zuò)基因靶向的通用(yòng)着陸平台，從而加快基因和細胞療法的臨床開發，但迄今為(wèi)止，人類基因組的任何位點都沒有(yǒu)得到充分(fēn)驗證，所有(yǒu)這些位點都隻能(néng)用(yòng)于研究應用(yòng)，”該研究的資深作(zuò)者，Wyss 核心教員 George Church 博士說。“這使得我們對高度驗證的 GSH 采取的協作(zuò)方法向前邁出了重要一步。再加上我們在實驗室開發的更有(yǒu)效的靶向基因整合工(gōng)具(jù)，這些 GSH 可(kě)以為(wèi)未來的各種臨床翻譯工(gōng)作(zuò)提供支持。” Church 是 Wyss 研究所合成生物(wù)學(xué)平台的負責人，麻省理(lǐ)工(gōng)學(xué)院）。

篩選 GSH 的基因組

研究人員首先建立了一個計算管道，使他(tā)們能(néng)夠通過利用(yòng)來自人類細胞系和組織的大量可(kě)用(yòng)測序數據來預測基因組中(zhōng)可(kě)能(néng)用(yòng)作(zuò) GSH 的區(qū)域。“在這個逐步的全基因組掃描中(zhōng)，我們通過計算排除了編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域，包括參與腫瘤形成的蛋白質(zhì)，以及編碼某些類型的在基因表達和其他(tā)細胞過程中(zhōng)起作(zuò)用(yòng)的 RNA 的區(qū)域。我們還消除了包含所謂的增強子元件的區(qū)域，這些元件通常從遠(yuǎn)處激活基因的表達，以及包括染色體(tǐ)中(zhōng)心和末端的區(qū)域，以避免細胞分(fēn)裂過程中(zhōng)染色體(tǐ)複制和分(fēn)離的錯誤，“首先說——作(zuò)者 Erik Aznauryan，博士 “這給我們留下了大約 2 個，

Aznauryan 以研究生身份與蘇黎世聯邦理(lǐ)工(gōng)學(xué)院生物(wù)系統科(kē)學(xué)與工(gōng)程系 Sai Reddy 實驗室的其他(tā)成員開始了該項目，之後他(tā)作(zuò)為(wèi)研究生工(gōng)作(zuò)的一部分(fēn)訪問了 Church 實驗室，在那裏他(tā)與 Wyss 技(jì )術開發研究員 Denitsa Milanova 博士合作(zuò).D。此後，他(tā)作(zuò)為(wèi)博士後研究員加入了 Church 的團隊。Reddy 是該合作(zuò)研究的高級作(zuò)者和主要作(zuò)者，是蘇黎世聯邦理(lǐ)工(gōng)學(xué)院系統和合成免疫學(xué)副教授，專注于開發系統和合成生物(wù)學(xué)的新(xīn)方法，以設計用(yòng)于各種研究和臨床應用(yòng)的免疫細胞。

在已确定的 2,000 個 GSH 位點中(zhōng)，研究小(xiǎo)組随機選擇了 5 個位點，并使用(yòng)基于 CRISPR-Cas9 的快速有(yǒu)效的基因組編輯策略将報告基因插入到每個細胞系中(zhōng)，并在常見的人類細胞系中(zhōng)對其進行研究。“其中(zhōng)兩個 GSH 位點允許插入的報告基因特别高表達——事實上，顯着高于團隊将相同報告基因工(gōng)程化到兩個早期 GSH 中(zhōng)所達到的表達水平。重要的是，兩個 GSH 位點所包含的報告基因并沒有(yǒu)上調任何與癌症相關的基因，”Aznauryan 說。這也可(kě)能(néng)成為(wèi)可(kě)能(néng)，因為(wèi)基因組中(zhōng)的區(qū)域在線(xiàn)性DNA中(zhōng)彼此遠(yuǎn)離 染色體(tǐ)序列，但在三維基因組中(zhōng)，折疊染色體(tǐ)的不同區(qū)域相互接觸，當插入一個額外的基因時，可(kě)能(néng)會受到共同影響。

眼科(kē)臨床翻譯

為(wèi)了評估對細胞和基因治療感興趣的人類細胞類型中(zhōng)兩個最引人注目的 GSH 位點，研究小(xiǎo)組分(fēn)别在免疫 T 細胞和皮膚細胞中(zhōng)研究了它們。T 細胞用(yòng)于許多(duō)過繼細胞療法，用(yòng)于治療癌症和自身免疫性疾病，如果将受體(tǐ)編碼基因穩定地插入 GSH，這些療法可(kě)能(néng)會更安(ān)全。此外，由控制不同皮膚層細胞功能(néng)的基因的有(yǒu)害突變引起的皮膚病可(kě)能(néng)通過将突變基因的健康拷貝插入和長(cháng)期表達到補充這些層的分(fēn)裂皮膚細胞的 GSH 中(zhōng)來治愈。

“我們将一個熒光報告基因引入從血液中(zhōng)獲得的原代人類 T 細胞中(zhōng)的兩個新(xīn) GSH，并将一個功能(néng)齊全的LAMB3基因（皮膚中(zhōng)的一種細胞外蛋白）引入原代人真皮成纖維細胞的相同 GSH，并觀察到持久的活性，”米蘭諾娃說。“雖然這些 GSH 具(jù)有(yǒu)獨特的優勢，可(kě)以提高治療用(yòng)母細胞和子細胞中(zhōng)基因表達的水平和持久性，但我對新(xīn)興的‘功能(néng)獲得’細胞增強功能(néng)感到特别興奮，這些增強功能(néng)可(kě)以增強細胞和器官的正常功能(néng)。因此，安(ān)全方面至關重要。” Milanova 與 Wyss 的創業團隊合作(zuò)，正在開發一個基因再生和增強平台，重點是皮膚再生。

“我們在 GSH 工(gōng)程改造的原代人類 T 細胞中(zhōng)進行的廣泛測序分(fēn)析清楚地表明，這種插入對引起腫瘤促進作(zuò)用(yòng)的可(kě)能(néng)性很(hěn)小(xiǎo)，這在基因修飾細胞用(yòng)于治療用(yòng)途時始終是一個主要問題，”Reddy 說。“正如我們在這裏所做的那樣，對多(duō)個 GSH 位點的識别也支持了構建更先進的細胞療法的潛力，這些療法使用(yòng)多(duō)種轉基因來編程複雜的細胞反應，這與用(yòng)于癌症免疫治療的 T 細胞工(gōng)程特别相關。”

“這項跨學(xué)科(kē)合作(zuò)展示了将計算方法與基因組工(gōng)程相結合的力量，同時保持對臨床翻譯的關注。人類基因組中(zhōng) GSH 的鑒定将極大地增強未來的開發治療工(gōng)作(zuò)，重點是設計更有(yǒu)效和更安(ān)全的基因和細胞療法，”Wyss 創始董事 Donald Ingber 博士說，他(tā)也是Judah Folkman HMS 和波士頓兒童醫(yī)院血管生物(wù)學(xué)教授，哈佛約翰 A. 保爾森工(gōng)程與應用(yòng)科(kē)學(xué)學(xué)院生物(wù)工(gōng)程教授。

參考文(wén)獻：“發現和驗證用(yòng)于基因和細胞療法的人類基因組安(ān)全港位點”，作(zuò)者 Erik Aznauryan、Alexander Yermanos、Elvira Kinzina、Anna Devaux、Edo Kapetanovic、Denitsa Milanova、George M. Church 和 Sai T.Reddy，2022 年 1 月 14 日，細胞報告方法。
DOI: 10.1016/j.crmeth.2021.100154

該研究的其他(tā)作(zuò)者是 Reddy 小(xiǎo)組的成員 Alexander Yermanos 博士和 Edo Kapetanovic；瑞士巴塞爾大學(xué)的 Anna Devaux；以及麻省理(lǐ)工(gōng)學(xué)院麥戈文(wén)腦研究所的 Elvira Kinzina。該研究得到了 ETH 研究基金、HMS 的 Helmut Horten 基金會和衰老與長(cháng)壽相關研究基金以及 Synthego 到 Aznauryan 的 2019 年基因組工(gōng)程師創新(xīn)基金的支持。