胚胎幹細胞(Embryonic stem cell,簡稱ESC)是一類具(jù)有(yǒu)多(duō)能(néng)性的幹細胞。在卵細胞受精(jīng)後,受精(jīng)卵經過桑葚胚階段,進入囊胚階段。囊胚中(zhōng)的細胞可(kě)以歸入兩個大類:滋養層(trophoblast,TE)和内細胞群(inner cell mass,ICM)。滋養層的細胞會分(fēn)化為(wèi)胚胎外的組織(胎盤等),内細胞群的細胞則會分(fēn)化成胚胎的其餘結構。分(fēn)離内細胞群細胞并進行體(tǐ)外(in vitro)培養,即可(kě)取得胚胎幹細胞。胚胎幹細胞擁有(yǒu)分(fēn)化為(wèi)三個胚層的細胞的潛能(néng),或者說在一般情況下能(néng)分(fēn)化形成除了胎盤之外的所有(yǒu)胚胎結構,此為(wèi)胚胎幹細胞多(duō)能(néng)性的具(jù)體(tǐ)體(tǐ)現。
1981年,英國(guó)劍橋大學(xué)遺傳學(xué)部中(zhōng),兩個分(fēn)别由馬丁·埃文(wén)斯(Martin Evans)以及馬修·考夫曼(Matthew Kaufman)率領的研究團隊分(fēn)别在體(tǐ)外建立了小(xiǎo)鼠胚胎幹細胞系。而胚胎幹細胞這一術語則是由加州大學(xué)舊金山(shān)分(fēn)校(UCSF)解剖學(xué)部的教授蓋爾·馬丁(Gail R. Martin)于當年12月的一篇論文(wén)中(zhōng)首次提出[2]。1998年,威斯康星大學(xué)教授詹姆斯·湯姆森(James Thomson)等人成功建立了人胚胎幹細胞系。2007年,馬丁·埃文(wén)斯與另外兩名(míng)科(kē)學(xué)家因“利用(yòng)胚胎幹細胞引入特異性基因修飾的原理(lǐ)上的發現”而獲得當年諾貝爾生理(lǐ)學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。
胚胎幹細胞被認為(wèi)在再生醫(yī)學(xué)、組織工(gōng)程、藥物(wù)實驗等領域擁有(yǒu)廣闊的應用(yòng)前景,胚胎幹細胞對發育生物(wù)學(xué)的基礎研究也有(yǒu)很(hěn)大助益。但是,因為(wèi)道德(dé)、宗教與法律上的問題(比如目前分(fēn)離胚胎幹細胞的方法會無可(kě)避免地殺死胚胎),有(yǒu)關胚胎幹細胞的研究(即治療性克隆)在各國(guó)都受到了一定的限制。
性質(zhì)與特征
胚胎幹細胞來自囊胚的内細胞群(ICM),并進行體(tǐ)外(in vitro)培養取得。胚胎幹細胞具(jù)有(yǒu)多(duō)能(néng)性,在一定條件下能(néng)夠分(fēn)化為(wèi)三個胚層(外胚層、中(zhōng)胚層、内胚層)的細胞,形成生物(wù)體(tǐ)的各種結構。胚胎幹細胞的形态與基因表達情況與其他(tā)細胞有(yǒu)明顯的不同。
形态學(xué)
胚胎幹細胞為(wèi)球狀,人胚胎幹細胞直徑約為(wèi)14μm,而鼠胚胎幹細胞直徑約為(wèi)8μm。胚胎幹細胞的細胞核一般較大,核仁明顯,而細胞質(zhì)相對較少。人和小(xiǎo)鼠的胚胎幹細胞都能(néng)在培養皿上形成圓形、邊界清晰、表面光滑的細胞集落。
分(fēn)子細胞生物(wù)學(xué)
胚胎幹細胞多(duō)能(néng)性的維持依賴于Sox2、Oct4、Nanog等因子構成的轉錄網絡,确保與細胞自我更新(xīn)能(néng)力有(yǒu)關的基因能(néng)夠持續高水平表達,并抑制與分(fēn)化、自噬相關的基因轉錄。在胚胎幹細胞的分(fēn)化過程中(zhōng),細胞的基因表達情況會發生很(hěn)大變化,尤其是與胚胎幹細胞自我更新(xīn)能(néng)力維持有(yǒu)關的基因。
胚胎幹細胞的自我更新(xīn)和分(fēn)化與表觀遺傳學(xué)途徑有(yǒu)密不可(kě)分(fēn)的聯系。首先是組蛋白的化學(xué)修飾:在胚胎幹細胞中(zhōng),與自我更新(xīn)相關的基因所在區(qū)域組蛋白H3K27高度乙酰化,這些區(qū)域中(zhōng)既有(yǒu)組蛋白乙酰基轉移酶,也有(yǒu)去乙酰化酶。這兩種作(zuò)用(yòng)效果完全相反的酶使H3K27的乙酰化水平維持動态平衡,便于基因能(néng)在外界信号發生改變時迅速關閉。另外,PRC1與PRC2兩種重要的蛋白質(zhì)會使H3K27、H3K4發生甲基化而沉默與分(fēn)化相關的基因,使其不表達。胚胎幹細胞多(duō)能(néng)性的維持與RNA幹擾也有(yǒu)緊密聯系。比如,PRC1與PRC2還會沉默編碼與分(fēn)化相關的miRNA,使胚胎幹細胞維持多(duō)能(néng)性;而let-7(一種miRNA)的表達則會使胚胎幹細胞開始分(fēn)化。受精(jīng)卵發育早期,基因組所有(yǒu)的DNA甲基化都會由甲基轉移酶Dmnt1消除;而與胚胎幹細胞自我更新(xīn)有(yǒu)關的基因區(qū)域會在分(fēn)化過程中(zhōng)再次甲基化,這些基因的表達也随之停止。
胚胎幹細胞多(duō)能(néng)性的維持還需要依靠胞外微環境提供适宜的信号,否則,胚胎幹細胞很(hěn)容易分(fēn)化為(wèi)其他(tā)類型的細胞。過去,胚胎幹細胞的培養需要在有(yǒu)一層喂養層細胞的培養基上進行。喂養層細胞一般是經絲裂黴素等有(yǒu)絲分(fēn)裂阻斷劑處理(lǐ)過的胚胎成纖維細胞,這些細胞能(néng)分(fēn)泌特定的信号分(fēn)子模拟早期胚胎發育的微環境,使胚胎幹細胞維持不分(fēn)化的狀态。目前,在培養基内加入白血病抑制因子(LIF)等細胞信号分(fēn)子就能(néng)夠在無喂養層的培養基上培養胚胎幹細胞。
分(fēn)離、鑒定與培養
胚胎幹細胞的分(fēn)離與培養
分(fēn)離囊胚的内細胞群(ICM)細胞,再進行體(tǐ)外培養即可(kě)取得胚胎幹細胞。目前,取得胚胎幹細胞的方法已有(yǒu)一定改進,但仍無可(kě)避免地會殺死胚胎。
囊胚由兩大部分(fēn)構成:處于外圍的滋養層以及處于内部的内細胞群。滋養層細胞會分(fēn)化為(wèi)胚胎外的組織(胎盤等),而内細胞群則會分(fēn)化為(wèi)胚胎的各種結構。
最早期分(fēn)離胚胎幹細胞的方法是先用(yòng)蛋白酶分(fēn)解透明帶的蛋白質(zhì)(囊胚外圍的一層細胞外基質(zhì)),再利用(yòng)免疫手術(immunosurgery)專一地使滋養層細胞裂解,從而取得内部的内細胞群細胞,之後體(tǐ)外培養和繁殖取得的内細胞群細胞,即可(kě)建立胚胎幹細胞系。目前胚胎幹細胞的分(fēn)離方法已有(yǒu)了一定的改進,比如現在已有(yǒu)使用(yòng)激光去除透明帶的技(jì )術。
獲取胚胎幹細胞的成功率相當低,即使成功取得胚胎幹細胞,維持其不分(fēn)化的狀态也十分(fēn)困難。為(wèi)了阻止胚胎幹細胞在培養過程中(zhōng)分(fēn)化,培養基需加入如白血病抑制因子(LIF)等因子。最初,胚胎幹細胞需要在含有(yǒu)喂養層細胞的培養基上培養。喂養層細胞能(néng)為(wèi)胚胎幹細胞提供特定的微環境,以抑制胚胎幹細胞的分(fēn)化。喂養層細胞常常使用(yòng)經過有(yǒu)絲分(fēn)裂阻斷劑(如絲裂黴素)處理(lǐ)過的胚胎成纖維細胞。目前已能(néng)在成分(fēn)清楚、無異物(wù)、不含有(yǒu)血清以及喂養層細胞的培養基上培養胚胎幹細胞。
胚胎幹細胞的鑒定
胚胎幹細胞可(kě)以通過細胞集落或細胞本身的形态初步鑒定;除此之外,還可(kě)以從分(fēn)子标記和分(fēn)化潛能(néng)等兩方面對胚胎幹細胞進行鑒定。
各基因的表達情況随細胞不同而異。因此,可(kě)以用(yòng)一些在細胞中(zhōng)特異性表達的蛋白質(zhì)對胚胎幹細胞進行鑒定。上述特異性表達的蛋白質(zhì)又(yòu)分(fēn)為(wèi)兩種類型:細胞内的蛋白質(zhì)以及細胞表面特異性的蛋白質(zhì)(細胞表面标記)。目前較常用(yòng)的細胞表面标記有(yǒu)SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81(前兩者為(wèi)階段特異性胚胎表面抗原,後兩者為(wèi)腫瘤識别抗原);而常選為(wèi)分(fēn)子标記的細胞内蛋白質(zhì)則有(yǒu)Oct4和Nanog等。免疫組織化學(xué)技(jì )術利用(yòng)能(néng)與這些分(fēn)子标記特異性結合的抗體(tǐ)來鑒定胚胎幹細胞,此外,這種技(jì )術也能(néng)與流式細胞分(fēn)選術、免疫磁珠等方法結合,用(yòng)于胚胎幹細胞的分(fēn)離。
特異性分(fēn)子标記的篩選可(kě)以采用(yòng)轉錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的技(jì )術,将胚胎幹細胞與其他(tā)細胞比對,以篩選出在胚胎幹細胞中(zhōng)特異性表達的蛋白質(zhì)。。
檢驗分(fēn)化潛能(néng)也可(kě)以達到鑒定胚胎幹細胞的目的。例如将小(xiǎo)鼠的胚胎幹細胞注射入其他(tā)的小(xiǎo)鼠胚胎中(zhōng),再使這個胚胎發育為(wèi)完整個體(tǐ),如果注射的胚胎幹細胞具(jù)有(yǒu)多(duō)能(néng)性,最後就能(néng)形成嵌合體(tǐ)(即該小(xiǎo)鼠的一部分(fēn)細胞基因型與其他(tā)部分(fēn)不同,該部分(fēn)細胞來自注射的胚胎幹細胞)。但是,考量倫理(lǐ)等方面的議題,上述方法并不适用(yòng)于人類等動物(wù)。鑒定人胚胎幹細胞的分(fēn)化潛能(néng)主要有(yǒu)兩種方法:體(tǐ)外培養形成拟胚體(tǐ)(embryoid body,EB)或注射入小(xiǎo)鼠體(tǐ)内形成畸胎瘤。在體(tǐ)外低黏附性培養皿上培養人胚胎幹細胞(或者懸浮培養人胚胎幹細胞)能(néng)使胚胎幹細胞形成一種特殊的結構,稱為(wèi)拟胚體(tǐ),形成拟胚體(tǐ)的胚胎幹細胞會分(fēn)化為(wèi)三大類分(fēn)别具(jù)有(yǒu)外胚層、中(zhōng)胚層、内胚層細胞特征的細胞,利用(yòng)不同的分(fēn)子标記即可(kě)鑒定這三個胚層的細胞。如果将人胚胎幹細胞注射入小(xiǎo)鼠體(tǐ)内,則可(kě)以觀察到畸胎瘤的形成,畸胎瘤的一些特征與早期胚胎相似,含有(yǒu)三大類分(fēn)别具(jù)外胚層、中(zhōng)胚層、内胚層細胞特征的細胞。
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